MATERIAL DE APOYO UNIDAD: INTEGRACIÓN CÉLULA- ORGANISMO

 

1. Diferenciación de células troncales y su importancia en la mantención de distintos tejidos.

 

Las células troncales son las que  se diferencian en células de tejidos específicos. En algunos tejidos, como el hígado, frente a daño traumático o por drogas se producen células diferenciadas de reemplazo por simple proliferación de células previamente diferenciadas que generan células hijas del mismo tipo. Sin embargo, en muchos otros tejidos adultos, donde hay continuamente un recambio de células, las nuevas células diferenciadas de reemplazo se generan continuamente a partir de células troncales aparentemente no-diferenciadas.

 

En el intestino, las células troncales no diferenciadas se encuentran en el fondo de las criptas. Cuando estas células se diferencian, empiezan a migrar hacia las criptas, reemplazando a las células que mueren al terminar su ciclo de vida en la punta de las criptas. Las células muertas son eliminadas al lumen intestinal En el caso de la epidermis, las células troncales se encuentran en la base del epitelio.

 

Las características de las células troncales son:

1) No se encuentran diferenciadas completamente sino que están determinadas a diferenciarse en un cierto linaje;

2) pueden dividirse sin límites;

3) cuando se dividen, cada célula hija tiene dos opciones: puede permanecer como célula troncal o puede entrar en un proceso que la lleva a diferenciarse de manera terminal e irreversible.

 

Se requieren células troncales en los tejidos donde existe una necesidad recurrente de reemplazo de células diferenciadas que no tienen la capacidad de dividirse. En muchos tejidos, la condición de diferenciación completa es incompatible con la división celular.

 

2. Receptores y transducción de señales

 

Ninguna célula vive en el aislamiento. En un organismo multicelular existen mecanismos muy elaborados de transmisión e interpretación de señales que permiten una coordinación de la actividad celular en beneficio del organismo como un todo. Las señales intercelulares son interpretadas por una maquinaria compleja en la célula que responde a ellas.  Esto permite a cada célula comportarse de una manera particular y altamente regulada,  que depende de su posición y especialización en el organismo. La sobrevivencia del organismo depende crucialmente de una red de comunicación intercelular que coordina el crecimiento, la diferenciación y el metabolismo de la multitud de células que componen los diversos tejidos y órganos. Por ejemplo, cada célula se divide sólo en respuesta a señales que recibe de otras células. La importancia de este comportamiento socialmente controlado se hace claramente aparente cuando al fallar se produce un crecimiento celular anormal que resulta en cáncer y muerte del organismo.

 

Las células se comunican mediante moléculas-señales que son sintetizadas y liberadas al medio, pero también se comunican por señales de contacto directo. Además, el contacto de la célula con la matriz extracelular también genera respuestas en las células.

 

Sólo las células que poseen receptores para estas señales responden. Las señales pueden estar constituidas por diversos tipos de moléculas, tales como proteínas, pequeños péptidos, aminoácidos, nucleótidos, esteroides, retinoides, o derivados de ácidos grasos. También pueden ser gases disueltos, tales como óxido nítrico y monóxido de carbono. Muchas de estas moléculas son secretadas por exocitosis mientras otras difunden a través de la membrana plasmática.

 

La célula que responde a una señal particular de otra célula lo hace a través de una proteína llamada receptor, que interacciona específicamente con la molécula señal e inicia una respuesta. En muchos casos los receptores de señales son proteínas que se encuentran insertadas en la membrana plasmática y la atraviesan (proteínas de transmembrana). Cuando se unen a la molécula señal (ligando) en el extracelular se activan y generan una cascada de señales intracelulares que modifican la estructura de numerosos elementos celulares y finalmente el comportamiento de la célula. En algunos casos, los receptores se encuentran en el interior de la célula y por lo tanto las moléculas señales deben entrar primero a la célula para activarlos. En estos casos, las moléculas señales deben ser suficientemente pequelas e hidrofóbicas como para difundir a través de la membrana plasmática. Las moléculas señales secretadas participan en diversas formas de señalización: sináptica, endocrina, paracrina y autocrina. También existe comunicación directa por adhesión célula-célula.

 

Cuando las señales secretadas por una célula afecta sólo las células en el ambiente local el proceso de comunicación se llama paracrino. En este caso la señal no difunde lejos de la célula que la produce sino que es rápidamente unida por la célula blanco o es destruida por enzimas extracelulares o queda inmovilizada en la matriz extracelular. Una variante es el caso de la regulación autocrina, en la cual la célula que secreta la señal puede autoestimularse porque también posee el receptor para esa señal. Estos tipos de comunicación celular es importante durante el desarrollo y durante el control de la proliferación celular en la renovación y reparación de tejidos pero no es suficiente para lograr coordinar el comportamiento de un organismo multicelular complejo.

 

 En los organismos complejos existen conjuntos de células especializadas que tienen papeles específicos en la señalización entre partes remotas del organismo. Las más sofisticadas de estas células son las células nerviosas que se comunican a distancia gracias a sus largos procesos celulares (axones) por los que transcurren los impulsos nerviosos que finalmente estimulan la secreción del neurotransmisor en la terminal sináptica. Las otras células especializadas en la señalización que coordina la actividad de células remotas del organismos son las células endocrinas. Cómo las señales de estas células se transmiten a través de la difusión y del flujo sanguíneo, la comunicación endocrina es más lenta e imprecisa que la nerviosa.

Es importante destacar en este momento que la interacción de un receptor con una hormona gatilla respuestas celulares que involucran la acción de muchas otras proteínas, por ejemplo para generar movimiento o secreción.

 

La respuesta celular a las señales puede involucrar cambios en la expresión génica, en la forma celular y en la movilidad celular. Es decir, cambia el comportamiento celular.

Transducción de señales es el proceso por el cual una señal se convierte en una respuesta celular. La célula convierte un tipo de señal que le llega del exterior en otro que se transmite al intracelular, amplificándose el número de moléculas involucradas.

 

Las proteínas receptoras en la superficie celular se pueden agrupar en tres grandes grupos según el sistema de transducción de señales que utilizan:

a) receptores-canales iónicos que se abren o cierran por unión del ligando;

b) receptores asociados a proteínas que unen e hidrolizan GTP (GTPasas);

c) receptores-enzimas que fosforilan o desfosforilan otras proteínas.

 

Estudiemos cada una de ellas!!! :

 

a)   Los receptores-canales iónicos unen un pequeño número de neurotransmisores que inducen transitoriamente su apertura o cierre y están involucrados en procesos de rápida señalización entre células excitables eléctricamente. Pertenecen a una familia de proteínas que atraviesan varias veces la membrana

 

b)   Los receptores asociados a proteínas-G regulan indirectamente la actividad una enzima o un canal en la membrana plasmática. Entre el receptor y la enzima o el canal se interpone una proteína que une e hidroliza GTP (proteína-GTPasa). Todos los receptores asociados a proteínas-GTPasas pertenecen a una familia de proteínas que atraviesan siete veces de la membrana, y son las más abundantes. Incluyen la rodopsina y los receptores olfatorios. La activación de este tipo de receptores resulta en aumentos en la concentración intracelular de AMPc o calcio, que cumplen un papel de mensajeros intracelulares o segundos mensajeros. El AMPc y el calcio activan quinasas intracelulares que finalmente llevan a cambios en el comportamiento celular

c)    Receptores-enzima poseen actividad enzimática que es activada por el ligando. La mayoría son proteínas que atraviesan sólo una vez la membrana y poseen un sitio extracelular para la unión del ligando y un dominio catalítico intracelular, que generalmente fosforila proteínas. En general estos son receptores para factores de crecimiento.

 

Se requiere la acción de varias proteínas asociadas a la membrana plasmática para que una señal hormonal gatille una respuesta en la célula. Las señales extracelulares se unen a receptores específicos e inducen en ellos cambios en su conformación. La única función del ligando parece ser la de cambiar las propiedades del receptor. Esto inicia una secuencia de reacciones que lleva a la repuesta celular. Las reacciones consisten en cambios en la forma de ciertas proteínas intracelulares provocados por fosforilación o por unión de GTP.

En el caso de los receptores asociados a proteínas-G se inducen cambios en la concentración intracelular de AMPc o calcio que actúan como señales internas (segundos mensajeros) para activar proteínas quinasas. En cambio los receptores-enzimas generalmente son quinasas reguladas desde el exterior de la célula e inducen directamente cambios en el estado de fosforilación de diversas proteínas intracelulares.

Un mismo receptor se puede encontrar en distintos tipos celulares y gatillar distintas repuestas según la especialidad de la célula. Por ejemplo, las células de músculo estriado y las células pancreáticas exocrinas expresan receptores de acetilcolina. ¿Qué efectos tiene la acetilcolina en estas células? En unas induce la contracción mientras en las otras gatilla la secreción. El sistema de transducción de señales es similar en ambos tipos de células. La respuesta está determinada por la estructura y organización celular, adaptada a la especialización celular.

Receptor

Molécula de proteína o glicoproteína con una estructura tridimensional específica a la cual puede unirse una sustancia (por ejemplo, una hormona, neurotransmisor, citoquinas o antígeno) con una estructura complementaria; presente típicamente en la superficie de una membrana. La unión de una molécula complementaria a un receptor puede generar un proceso de transporte, activación o un cambio en los procesos que ocurren dentro de la célula.

La recepción de información por parte de una célula es una cuestión compleja. Para este propósito las células presentan un elaborado arreglo de proteínas de transmembrana llamados receptores, cuya función es adquirir información del espacio extracelular y transferir esta información al interior de la célula. Al respecto, los receptores de la superficie celular actúan como "antenas" de la célula.

Las células de los mamíferos tienen diversos tipos de receptores, de ellos describiremos a modo de ejemplo:

 

Receptores del factor de crecimiento

Una clase de receptores muy bien estudiados son los que ayudan a la célula a determinar si debe o no crecer. Como discutiremos mas adelante, en conexión con el ciclo celular, la célula determina si debe o no crecer a partir de los factores de crecimiento que se encuentran en el medio circundante.

Estos factores de crecimiento, algunas veces llamados mitogénicos porque inducen a la célula a crecer y a pasar a la fase de mitosis, son polipéptidos de unos 50 a 100 aminoácidos de longitud. Cuando está presente en suficiente cantidad, un factor de crecimiento (GF por "growht factor") estimulará a la célula para que entre en un ciclo de crecimiento y división.

Los GF actúan ligándose a los receptores que se encuentran en la superficie de la membrana. Cada GF se ligara al dominio extracelular de su receptor especifico y no al de otros factores de crecimiento.

Este dominio receptor extracelular puede imaginarse como una cavidad que acomoda el GF apropiado en una complementación tipo llave - cerradura excluyendo así a los otros factores.

Por lo tanto el factor de crecimiento de la epidermis (EGF) solo se ligara al receptor EGF en la superficie de la célula, pero no por ejemplo al receptor del factor de crecimiento de plaquetas.

En general, cada tipo de receptor se "pega" específicamente a su propio "ligando"

 

Transductores de membrana

La unión de un factor de crecimiento al dominio extracelular de su receptor es solo el comienzo del proceso de información. ¿Cómo se transmite al interior de la célula la "novedad" de este encuentro? Esta transmisión de información es lo que los bioquímicos llaman transducción de la señal.

La respuesta nace cuando se examina detalladamente la estructura de las proteínas receptoras de los factores de crecimiento. Externamente a la célula tienen un dominio N-terminal que actúa como ligando y le sigue el dominio de transmembrana.

En el extremo C-terminal (en el citoplasma) el dominio tiene características enzimáticas que solo se activan cuando el dominio receptor encuentra y liga un factor de crecimiento. En el caso de muchos receptores el dominio enzimático actúa como una protein - kinasa.

Las protein - kinasas son enzimas que usando el ATP, fosforilan a la proteína tranfiriéndole el fosfato gamma del mismo. Resultando de esta manera una proteína fosforilada. En el caso de los receptores de los factores de crecimiento, los fosfatos se agregan a la tirosina de la proteina-sustrato.

 

De acuerdo con esto los receptores se consideran que tienen actividad protein-tirosin kinasa, para distinguirlos de otros que pegan fosfatos a la serina o treonina de sus substratos.

La secuencia de eventos es la siguiente:

  1. Los factores de crecimiento se pegan al dominio extracelular de su receptor.

  2. Esto resulta en la activación del dominio tirosin-kinasa en la otra punta del receptor que se encuentra en el lado citoplasmático.

  3. La tirosin-kinasa activa, fosforila una serie de proteínas citoplasmáticas que, a su vez, resultan activadas o alteradas funcionalmente como consecuencia de haber sido fosforiladas.

  4. Luego proceden a mandar señales al núcleo que dan como resultado que la célula crezca y se divida.

 

Debe notarse que el ligando del factor de crecimiento no necesita ser físicamente transportado al interior para que la señal sea emitida. Toda la actividad de transmisión transmembrana de la señal ocurre con el ligando en el espacio extracelular.

Nada de esto nos dice la manera que el ligando externo causa la actividad tirosin-kinasa en el interior. Un gran numero de mecanismos puede producir tal efecto.

Uno de ello depende de dos importante factores bioquímicos.

Cuando un factor de crecimiento se liga a un receptor estimula la dimerización del mismo con otro que flota cerca de él en la membrana plasmática.

La dimerización del dominio extracelular produce en consecuencia que los dominios citoplasmáticos de dos receptores queden cercanos.

La tirosin-kinasa es una molécula receptora que fosforila el dominio kinásico del segundo receptor que quedo cercano luego de la dimerización. Esta fosforilación resulta en un cambio estérico del dominio fosforilado, causando su activación funcional.

En efecto, los dos dominios kinásicos una vez que están "cara a cara", se fosforilan (y por lo tanto activan) uno al otro. Una vez activados, fosforilan proteínas del citoplasma que a su vez pasan señales al interior de la célula.

 

Receptores proteicos G

El cuerpo usa receptores "serpiente" que atraviesan 7 veces la membrana en una sorprendente variedad de señales biológicas.

Receptores en nuestra lengua nos permiten apreciar el gusto.

Cientos de diferentes receptores de las células de nuestro tracto olfativo nos dan información de los olores.

Una molécula de carotenoide, relacionada con la vitamina A, se pega en la posición ligando de la rodopsina, en los conos y bastones de nuestros ojos, donde detectan fotones, alteran su configuración y causan que el receptor al cual están ligados mande señales al citoplasma del cono o bastón que resulta en nuestra percepción de la luz.

Estos receptores "serpiente" son de aparición muy antigua en la evolución. Las levaduras comunican su identidad sexual por medio de un polipeptido que actúa como factor de encuentro. Los receptores celulares que reconocen estos factores de encuentro son receptores "serpiente" que atraviesan 7 veces la membrana.

 

Un buen ejemplo de estos, es el muy estudiado receptor de la epinefrina.

Epinefrina

El ligando epinefrina, también conocido como adrenalina es liberado por la medula de las glándulas adrenales, que se encuentran encima de los riñones, por una gran variedad de estímulos "estresantes". Una vez liberada al torrente sanguíneo se liga a receptores específicos de la superficie celular en diversos tejidos del cuerpo. El resultado es el establecimiento de la primitiva reacción de alerta / huida .

Esta reacción incrementa el latido cardíaco, decrece el flujo sanguíneo al intestino, lo incrementa a los musculos esqueléticos, e incrementa los niveles de glucosa al causar que las células musculares y hepáticas desdoblen el glucógeno (forma de reserva de la glucosa) y liberen glucosa a la sangre.

¿Cómo produce la adrenalina estas respuesta? Actuando como ligando, se pega a los receptores específicos que se encuentran expuestos en la superficie de un gran numero de células del organismo. Este receptor , llamado beta-adrenergico, es un receptor tipo "serpiente" que se encuentra embebido en la membranas plasmática de estas células (la atraviesa 7 veces).

Como en el caso de los factores de crecimiento ya descriptos, la adrenalina no penetra en la célula, en vez de ello, uniéndose por un corto periodo de tiempo a su receptor, lo induce a liberar señales bioquímicas al citoplasma de las células.

Los receptores "serpiente", como el receptor beta adrenérgico no dependen de la dimerización del receptor para transducir la señal. En vez de ello, una molécula de receptor cambia su configuración estérica en respuesta al "pegado" del ligando. Este cambio estérico afecta la configuración del dominio citoplasmático de la proteína, esto es el "lazo" del receptor que protruye en el citoplasma.

 

Transducción de la señal

El receptor beta adrenérgico se comunica con el citoplasma estimulando una segunda proteína que se conoce como proteína G por razones que enseguida se entenderán. La proteína G generalmente se encuentra cerca del receptor en forma inactiva. Cuando el receptor es activado por un ligando , rápidamente actúa sobre la proteína G.

La proteína G responde rápidamente activándose a si misma y, ya en el estado activo, envía señales a otras moléculas del citoplasma celular. Sin embargo la proteína G solo permanecerá en estado activo por un breve periodo pasándose luego a la forma inactiva.

En efecto, la proteína G actúa como una llave binaria autoapagable (equivalente a una llave de luz autoapagable como las que se encuentran en muchos edificios ), que cuando esta "on" permanece así un pequeño periodo de tiempo hasta que se pone asimismo en "off".

Los dos estados (encendido/apagado) están determinados por el nucleótido de guanina que se encuentra pegado a ella (de allí el nombre de proteína G).

Cuando esta inactiva pega GDP (guanosín difosfato), cuando esta activa GTP (guanosín trifosfato) En consecuencia, la forma inactiva ("apagada") de la proteína G se presenta cuando la misma tiene ligado GDP.

Cuando el ligando se "pega" a ella, libera GDP y permite que el GTP se una. Esta forma de la proteína G que liga GTP, es la forma activada ("encendida") de la misma Cuando esta "encendida" libera señales al interior de la célula. Luego de un corto periodo (segundos o menos) la proteína G hidroliza el GTP a GDP y se "apaga" asimisma.

Esta hidrólisis representa un mecanismo de retroalimentación negativo que asegura que la proteína G solo estará activa por un corto tiempo.

 

EFECTO CASCADA

 

Se describirá brevemente el flujo de la señal (a menudo nombrado como efecto cascada) que es disparado por la proteína G activa. La proteína G esta formada por tres subunidades proteicas llamadas alfa, beta y gamma. En su forma inactiva las tres subunidades se encuentran unidas. La subunidad alfa es la que tiene el GDP. Cuando el receptor beta adrenérgico activa la proteína G, la subunidad alfa libera el GDP, pega GTP y luego se separa de las subunidades beta y gamma.

 

Cuando esto ocurre la subunidad alfa pierde su afinidad por el receptor, se disocia de el, y se mueve hacia otra proteína cercana, la enzima adenilato ciclasa, que hasta el momento estaba inactiva y que ahora es activada y comienza su trabajo: convertir el ATP en 3'5' AMP cíclico. Esta reacción implica liberar los fosfatos gamma y beta del ATP ligar el fosfato restante (que esta esterificando a la ribosa en la posición 5') al hidroxilo 3' formando una estructura cíclica conocida como "AMP cíclico" o simplemente AMPc.

 

Luego de varios segundos de la unión con la adenil-ciclasa, la subunidad alfa de la proteína G hidroliza el GTP , abandona la adenilato ciclasa y se pone en "off" (apagado) y retorna a su unión con las subunidades beta y gamma (lugar de donde había "desertado" al comienzo del "juego"). La adenil ciclasa se torna inactiva y deja de producir AMPc. Todo este ciclo origina un breve "pulso" de señales que producen, en este caso, unos cientos de moléculas de AMPc.

 

El AMPc actúa como un segundo mensajero que difunde por el citoplasma (el primer mensajero es el ligando en la superficie celular, estos ligandos son en general productos conocidos como hormonas: por ejemplo la epinefrina) llevando su acción al mismo. En ausencia de eventos como el señalado anteriormente, el nivel de AMPc en muy bajo, se eleva como consecuencia de este proceso y, como puede Ud. imaginarse, es rápidamente hidrolizado a AMP (no cíclico) con lo cual el estimulo termina.

 

En varios sitios de la célula el AMPc se pega a otra enzima una serina /treonina proteina-kinasa, llamada la AMPc-kinasa dependiente o simplemente ''A kinasa''. La A kinasa, una vez activada , puede fosforilar específicamente determinadas proteínas , específicamente en sus residuos serina/treonina, y al hacerlo las activa. En el caso de las células del hígado que almacenan grandes cantidades de glucógeno , el AMPc hace que la A-kinasa se active y

  1. fosforile y por lo tanto active una enzima que activa la glucogeno-fosforilasa, que a su turno rompe el glucógeno en moléculas de glucosa-1-fosfato; y

  2. fosforila la glucógeno sintetasa, y de esta manera haciendo que la misma no trabaje, e impidiendo la reconversión del glucosa en glucógeno. Estos dos cambios (activación de la enzima que degrada, e inhibición de la enzima que sintetiza) aseguran la movilización del glucógeno almacenado en el hígado a glucosa. Otras reacciones son activadas de manera similar en otras células para contribuir a la respuesta de alerta / huida del organismo.

Esta "cascada " de reacciones aumenta enormemente la señal que llego a la célula. Una molécula de epinefrina causa la activación de la subunidad alfa del receptor, ella activara a una adenilato-ciclasa, la cual a su vez sintetizara cientos de AMPc. Cada uno de los AMPc puede activar una kinasa- AMPc - dependiente, que a su vez puede modificar cientos de moléculas en la célula..

 

Otro mecanismo de amplificación es el implicado en el fenómeno de erección del pene, los científicos determinaron que en este caso el ligando es el NO (oxido nítrico), que es el principal neurotransmisor en el pene . En este caso, a diferencia de los descriptos, el receptor es el hierro del grupo hemo de la enzima guanilato-ciclasa y el segundo mensajero es el GMPc (Guanosín-Monofosfato-ciclico) en vez del AMPc. Una fosfodiesterasa (la isoenzima tipo V es la predominante), esta implicada en la inactivación del GMPc y por ende en la finalización de su efecto. La inhibición de esta fosfodiesterasa es la base del efecto del UK 92480 , droga que actualmente se comercializa  para disfunciones de la erección dado que potencia la presencia del GMPc al impedir su destrucción.

 

 

 

    RESUMEN :

 

TIPOS DE RECEPTORES Y LOS MECANISMOS DE TRANSDUCCION DE SEÑALES

 

La respuesta celular a las señales puede involucrar cambios en la expresión génica, en la forma celular y en la movilidad celular.  Es decir, cambia el comportamiento celular.

 

Transducción de señales es el proceso por el cual una señal se convierte en una respuesta celular.  La célula convierte un tipo de señal que le llega del exterior en otro que se transmite al intracelular, amplificándose el número de moléculas involucradas.

 

 

 

 

Las proteínas receptoras en la superficie celular se pueden agrupar en tres grandes grupos según el sistema de transducción de señales que utilizan: a) receptores-canales iónicos que se abren o cierran por unión del ligando; b) receptores asociados a proteínas que unen e hidrolizan GTP (GTPasas); c) receptores-enzimas que fosforilan o desfosforilan otras proteínas.

 

 

 

a)    Los receptores-canales iónicos unen un pequeño número de neurotransmisores que inducen transitoriamente su apertura o cierre y están involucrados en procesos de rápida señalización entre células excitables eléctricamente.  Pertenecen a una familia de proteínas que atraviesan varias veces la membrana.

 

b)    Los receptores asociados a proteínas-G regulan indirectamente la actividad de una enzima o un canal en la membrana plasmática.  Entre el receptor y la enzima o el canal se interpone una proteína que une e hidroliza GTP (proteína-GTPasa).  Todos los receptores asociados a proteínas-GTPasas pertenecen a una familia de proteínas que atraviesan siete veces la membrana, y son las más abundantes.  Incluyen la rodopsina y los receptores olfatorios.  La activación de este tipo de receptores resulta en aumentos en la concentración intracelular de AMPC o calcio, que cumplen un papel de mensajeros intracelulares o segundos mensajeros.  El AMPC y el calcio activan quinasas intracelulares que finalmente llevan a cambios en el comportamiento celular.

 

c)    Receptores-enzima poseen actividad enzimática que es activada por el ligando.  La mayoría son proteínas que atraviesan sólo una vez la membrana y poseen un sitio extracelular para la unión del ligando y un dominio catalítico intracelular, que generalmente fosforila proteínas.  En general estos son receptores para factores de crecimiento.

 

 

 

 

Cambios en las proteínas intracelulares durante la transducción de señales

                              

Se requiere la acción de varias proteínas asociadas a la membrana plasmática para que una señal hormonal gatille una respuesta en la célula. Las señales extracelulares se unen a receptores específicos e inducen en ellos cambios en su conformación. La única función del ligando parece ser la de cambiar las propiedades del receptor. Esto inicia una secuencia de reacciones que lleva a la respuesta celular. Las reacciones consisten en cambios en la forma de ciertas proteínas intracelulares provocados por fosforilación o por unión GTP.

En el caso de los receptores asociados a proteínas G se inducen cambios en la concrentración intracelular de AMPc o calcio que actúan como señales internas( segundos mensajeros) para activar proteínas quinasas. En cambio los receptores- enzimas generalmente son quinasas reguladas desde el exterior de la célula e inducen directamente cambios en el estado de fosforilación de  diversas proteínas intracelulares.

Un mismo receptor se puede encontrar en distintos tipos celulares y gatillar distintas respuestas según la especialidad de la célula: Por ejemplo, las células del músculo estriado  y las células pancreáticas exocrinas expresan receptores de acetilcolina. ¿qué efectos tiene la acetilcolina en las células? En unas induce la contracción mientras en otras promueve o estimula la secreción. El sistema de transducción de señales es similar en ambos tipos de células. La respuesta determinada por la estructura y organización celular, adaptada a la especialización celular.

Relacionar la unión del ligando con una respuesta generaliza de la célula.

¿Cómo es posible que la unión de una hormona a receptores específicos en la superficie celular, que representan una millonésima de fracción de las proteínas totales de la célula, gatille una respuesta celular global que involucro la participación de una gran proporción de proteínas celulares? 

 

Tipos de respuestas celulares a los estímulos

 

 

 Analicemos ahora ...

 

3. Comunicación intercelular : célula-célula

Las células  de un organismo multicelular necesitan comunicarse con el fin de regular el desarrollo, controlar el crecimiento y regular las diferentes funciones de modo que las partes del organismo se desempeñan como unidad.

Existen tres modalidades de comunicación intercelular:

De estas tres, la más frecuente son  las mediadas por sustancias químicas. Este tipo de comunicación puede ser endocrina, paracrina o sináptica.

 

Todos estos mensajeros ejercen su acción uniéndose a proteínas receptoras que existen en las células de destino. Estos receptores pueden estar en la membrana celular o bien en el interior de la célula, por ejemplo en el núcleo.  Para un mismo mensajero pueden existir, en distintos tejidos, diferentes receptores.  Esto hace que un mismo mensajero pueda ejercer diferentes efectos en distintos tejidos.  Por ejemplo, un mismo neurotransmisor puede provocar la contracción de un músculo, la relajación de otro y la secreción en una glándula.

 

- los relacionados con canales. La unión del mensajero provocas la apertura o el cierre de ciertos canales iónicos, es decir, altera transitoriamente la permeabilidad celular.

- los catalíticos . La unión de los mensajeros causa la activación de su actividad enzimática propia.

- los relacionados con proteínas G . Son aquellos que, al unirse con su mensajero, provocan el aumento intracelular de una sustancia que es la responsable del efecto, llamada segundo mensajero. Esto lo hacen con la participación de una proteína de membrana llamada proteína G: Dos segundos mensajeros bien conocidos son el c-AMP y el calcio . El primero se forma a partir de ATP gracias a la acción de una enzima asociada a la proteína G llamada adenilato-ciclasa. El AMP, a su vez, causa la activación de unas proteínas que unen grupos fosfato a otras enzimas, con lo cual pueden activarlas o desactivarlas. El calcio se libera hacia el citosol desde resorvorios citoplasmáticos tales como el retículo endoplasmático. El catión puede unirse a una proteína calmodulina para activarla, la cual, a su vez, activa a otras enzimas.

 

UNIONES INTERCELULARES Y MATRIZ EXTRACELULAR

- Uniones oclusivas o herméticas. Están constituidas por proteínas existentes entre las células y cuya unión sella a una célula con su vecina como si las monocapas lipídicas externas hubiesen sido “cosidas a máquina” a una con otra. De  esta forma, los epitelios constituyen verdaderas barreras herméticas  entre compartimentos corporales distintos, obligando a las sustancias a pasar por dentro de las células del epitelio para pasar de un compartimento a otro, lo que permite la regulación por parte de la célula.

 

- Uniones de anclaje. Constituyen puntos en que se anclan filamentos del citoesqueleto para unir firmemente una célula a otra o al material extracelular. Un tipo de ellas son los desmosomas, especies de broches de presión a los que se anclan filamentos de queratina y que les confieren a los tejidos una gran resistencia mecánica, lo que es de gran importancia en epitelios como la piel o del tubo digestivo, porque se estiran.

 

- Uniones de comunicación. Son uniones que conectan los citoplasmas de células adyacentes. Un ejemplo de ellas son las que existen entre las células del músculo cardíaco. Su finalidad es acoplar eléctrica y metabólicamente a las células de un tejido. En las plantas existe un tipo de estas comunicaciones, llamadas plasmodesmos.

 

En los multicelulares existen dos tipos bien definidos de tejidos, aunque éstos no son los únicos. Nos referiremos a los tejidos epiteliales y a los conjuntivos.

·        Los tejidos epiteliales son capas que revisten o cubren superficies corporales o cavidades. Tienen muy poco material extracelular y las uniones intercelulares desempeñan en ellos un papel fundamental. Estas uniones pueden ser de tres tipos:

 

·        Los tejidos conjuntivos, o conectivos, como hueso, cartílago y tendones, están constituidos por muy pocas células y por una gran cantidad de material extracelular llamado matriz extracelular. Esta matriz mantiene la organización de los tejidos, determina su comportamiento y permite migraciones celulares. Está formado por dos tipos de proteínas: adhesivas y estructurales. De estas últimas, las más importantes son el colágeno y la elastina, ambas fibrosas.


 

Las células en tejidos: Adhesión celular

 

En plantas y animales, las células especializadas en las distintas tareas funcionan de manera altamente coordinada formando tejidos y órganos. Una etapa clave en la evolución de los organismos multicelulares debe haber sido la adquisición de la capacidad que hoy vemos en las células para establecer contactos fuertes y específicos con otras células. Esta capacidad se basa en la función de proteínas integrales de membrana llamadas moléculas de adhesión celular. Las interacciones entre estas moléculas dispuestas en la superficie de distintas células permite que poblaciones de células se organicen en tejidos y órganos. Las células primero se agregan reconociéndose entre ellas a través de las moléculas de adhesión y luego forman elaboradas uniones intercelulares que estabilizan las interacciones iniciales y promueven la comunicación local entre las células en contacto.

 

Además, las células animales secretan glicoproteínas que forman una compleja red llamada matriz extracelular con la cual se crea un ambiente especial en los espacios intercelulares. La matriz extracelular ayuda a las células a mantenerse unidas en los tejidos y constituye un reservorio de numerosas hormonas que controlan la proliferación y diferenciación celular. También provee un substrato sobre el cual las células pueden moverse, especialmente en los primeros estados de la diferenciación y organogénesis. Defectos en estas conexiones pueden llevar al desarrollo de cáncer y malformaciones del desarrollo.

 

La matriz extracelular está formada por tres proteínas principales: a) proteoglicanes, proteínas altamente viscosas que sirven como de colchón a las células; b) colágeno, que forma fibras resistentes dando firmeza a los tejidos; c) proteínas solubles altamente adhesivas, que se unen a los otros dos componentes y a receptores en la superficie celular. Las combinaciones entre estos componentes varían en distintos tejidos y dan diferentes cualidades a la matriz extracelular. Por ejemplo, firmeza en los tendones, amortiguación en los cartílagos o adhesión en el espacio intercelular. La matriz extracelular que rodea a las células musculares lisas de una arteria provee firmeza y elasticidad al vaso.

 

La matriz extracelular no es inerte. También puede ser fuente directa e indirecta (presentando hormonas) de señales que evocan respuestas en las células que interaccionan con ella a través de receptores específicos. Juega un papel crucial en el proceso de desarrollo embrionario,  durante el cual la matriz extracelular se está constantemente remodelando, degradando y resintetizando localmente.  En el organismo adulto, ocurre degradación y resíntesis durante procesos de reparación de heridas.

 

Las células interactúan entre ellas a través de cadherinas y con la matríz extracelular a través de integrinas, ambas proteínas de adhesión celular integrales de la membrana plasmática.

 

La adhesión de células semejantes es una característica fundamental en la arquitectura de muchos tejidos. Un tipo de tejido importante en la interacción del organismo con el medio es el tejido epitelial, en el cual las células forman una capa que tapiza y separa compartimentos externos e internos del organismo. Las células que componen un epitelio muestran distintos tipos de uniones intercelulares y de interacciones con la matriz extracelular. Hay fundamentalmente cuatro tipos de uniones de las células con elementos del medio que la rodea: a) las uniones estrechas, que forman un anillo alrededor de la célula y un contacto intercelular que impide el paso de iones. Es fundamental para mantener la composición del medio interno del organismo; b) las uniones en hendidura que forman especies de túneles de conexión entre el compartimento citosólico de dos células adyacentes, por los cuales pueden pasar moléculas pequeñas; c) uniones célula-célula y célula-matriz extracelular a través de proteínas llamadas cadherinas e integrinas, respectivamente. Estas uniones cumplen la simple función de mantener las células en posición dentro de un tejido.

 

La unión se realiza conectando el citoesqueleto celular  a la superficie de la otra célula o a la matriz extracelular a través de las cadherinas o integrinas que atraviesan la membrana plasmática. La interacción de las proteínas que atraviesan la membrana con el citoesqueleto es importante para dar resistencia a los puntos de contacto intracelular.

 

 

Como ejemplo tenemos:

Expresión de la molécula de adhesión cadherina e invasividad medida in vitro en líneas celulares provenientes de diversos tumores humanos.

 

La generación de tumores malignos en humanos y en animales de experimentación es un proceso de múltiples etapas. La acumulación de mutaciones resulta en la pérdida del control de la proliferación y pérdida de la adhesión celular con inducción de la invasión a otros tejidos. La invasión celular de otros tejidos (metástasis) es promovida cuando disminuye la expresión de moléculas de adhesión responsables de mantener  a las células en su sitio. Las células cancerosas invasoras rompen los contactos con el tejido al que pertenecen.  Esto se puede ver en cultivo. Las células que dejan de expresar una molécula de adhesión como cadherina muestran aumento de su motilidad e invasividad de la matriz extracelular. En el organismo, las células cancerosas que se desarrollan en epitelios se desligan de sus contactos, pasan a través de la matriz extracelular e invaden otros tejidos. Esta característica de invasividad es propia de las células cancerosas.

 

 

 

4. Aplicaciones del conocimiento sobre biología celular

 

a. Anticuerpos monoclonales

El problema que existía para utilizar anticuerpos en la detección y aislamiento de proteínas. La especificidad de los anticuerpos es una herramienta muy útil en la investigación de la función de proteínas particulares. La marcación de anticuerpos con moléculas fluorescentes o con oro coloidal permite la localización de proteínas en la célula mediante microscopía de fluorescencia o electrónica, respectivamente. También son utilizados para detectar proteínas en experimentos bioquímicos mediante inmunoprecipitación o inmunoblot. Acoplados a una matriz, pueden ser utilizados para aislar proteínas desde un extracto celular. Si el antígeno se encuentra en la superficie celular se pueden utilizar anticuerpos para aislar células que poseen un determinado antígeno mediante la captura de las células que tienen unido un anticuerpo.

Los anticuerpos contra proteínas en estudio se producen generalmente inyectando conejos varias veces con la proteína purificada. El anti-suero que se obtiene contiene una mezcla heterogenea de anticuerpos, cada uno producido por un clon de células secretoras de anticuerpos (linfocitos B). Estos anticuerpos reconocen varios sitios antigénicos (epítopos) en la molécula de interés, pero también pueden reconocer las impurezas presentes en la preparación de la proteína que se inyectó. Este problema muchas veces entorpece los ensayos por un efecto de trasfondo que no es deseado en los experimentos.

En 1976 se solucionó el problema de la heterogeneidad al desarrollarse una técnica que ha revolucionado el uso de anticuerpos como herramientas en biología celular y abrió nuevas posibilidades de uso en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades.

El principio del procedimiento es propagar un clon de células productoras de anticuerpos de manera que se pueda obtener un anticuerpo homogéneo en grandes cantidades. El problema práctico es que los linfocitos B sólo viven un tiempo limitado en cultivo. Para solucionar el problema se logró fusionar linfocitos B productores de anticuerpos con células inmortales derivadas de un tumor de células B y luego seleccionar las células híbridas que tienen la doble capacidad de producir un anticuerpo específico contra una molécula de interés y crecer indefinidamente en cultivo. Estos llamados hibridomas se propagan como clones individuales, cada uno de los cuales provee una fuente permanente y estable de un sólo tipo de anticuerpo (monoclonal). Este anticuerpo reconocerá sólo un epítopo en la superficie de una proteína.

Además de solucionar los problemas de la heterogeneidad, otra gran utilidad de los anticuerpos monoclonales es que se pueden obtener incluso utilizando preparaciones muy impuras de la proteína de interés. El procedimiento de selección posterior permite aislar los clones que están produciendo anticuerpos contra la proteína en estudio e incluso utilizar estos anticuerpos en su aislamiento.

 

b.EVOLUCION DE LOS CULTIVOS CELULARES

El cultivo de células tuvo su origen en el siglo XIX. Rechlinhausen en 1866, mantuvo vivas células sanguíneas de anfibio, pero fue la utilización de bloques de agar con plasma coagulado (soporte y alimento) el inicio del cultivo de células in vitro (Freshney, 1987).

El desarrollo del cultivo de células de vertebrados se inició con las observaciones de Roux (1885) en cultivos de células de embrión de pollo; posteriormente Harrison (1907) cultivó tejido nervioso de rana el cual más adelante fue reemplazada por plasma de pollo (Burrows 1910); posteriormente, Carrel en 1912 aplicó esta técnica para el estudio en animales de sangre caliente.

Una serie de innovaciones como el desarrollo de medios de cultivo (Eagle, 1955), el uso de antibióticos, las técnicas de tripsinización para el pasaje de células (Moscona y Moscona, 1952) y la suplementación del medio con suero fetal bovino, permitieron el desarrollo y aplicabilidad de los cultivos de células de origen vertebrado.

El empleo de técnicas de fusión celular (Barski, 1960; Littlefield, 1964) estableció las bases de la genética de células somáticas para el análisis de especies animales (incluyendo al hombre); igualmente la técnica de anticuerpos monoclonales (Kohler y Milstein, 1975) ha permitido estudios en inmunología y su aplicación a nivel terapéutico.

 

EN QUE CONSISTE UN LABORATORIODE CULTIVOS CELULARES

Un laboratorio de cultivo celular debe contar con una infraestructura básica en la cual se disponga de áreas independientes para llevar a cabo la preparación y esterilización de medios y reactivos, un espacio independiente para el proceso de lavado y preparación de material y un área propiamente destinada al trabajo con cultivos celulares.

Dentro de la infraestructura física básica se debe contar con sistemas de refrigeración y congelación, incubadoras, centrífugas, balanzas, microscopios y cabinas de flujo laminar.

Adicionalmente, se debe disponer de un buen suplemento de material plástico y de vidrio y con sistemas de esterilización apropiados para los diferentes tipos de reactivos y material utilizados.

Desde el punto de vista de los sistemas de esterilización se pueden citar los siguientes:

Calor Húmedo: Mediante el empleo de autoclaves los cuales proporcionan una temperatura de 121oC y una presión de 15 lb. Utilizados para la esterilización de soluciones cuyos componentes no se degradan por éste método, material plástico y de vidrio y equipos de filtración.

Calor Seco: lo constituye el uso de hornos a temperatura de 200oC por espacio de 3 horas. Es empleado para la esterilización de material de vidrio particularmente.

Filtración: A través del uso de equipos con membrana de nitrocelulosa o acetato de celulosa con poro de 0.22 ó 0.1 u de diámetro, mediante la aplicación de presión positiva o negativa. Por éste sistema se esterilizan la mayor parte de los medios de cultivo, suero, solución de antibiótico-antimicótico y suplementos.

 

 

CLASES DE CULTIVOS CELULARES

Los cultivos celulares son el producto de la colección de células animales de diferentes órganos, colocadas en condiciones especiales propicias para su sobrevivencia y multiplicación, manteniendo para esto todas sus funciones metabólicas de una manera semejante a las que tenía en el huésped.

Los cultivos de células animales se han clasificado de acuerdo a su capacidad de anclaje (adherencia), y así han sido aisladas recientemente de un órgano determinado o si provienen de células que han sufrido modificación.

De acuerdo a su capacidad de adherencia o no a una superficie determinada pueden crecer formando monocapa o en suspensión respectivamente, lo que está muy asociado con el tipo de célula de la cual derivan: por lo general las células provenientes de órganos, crecen en monocapa; igualmente existen células que pueden crecer indistintamente tanto en monocapa como en suspensión, ejemplo son las células HeLa que son células transformadas derivadas de cultivos en monocapa.

Cuando el cultivo proviene de células que han sido disgregadas de un tejido original tomado de un órgano de un animal recién sacrificado, reciben el nombre de Cultivo Primario; cuando éste cultivo primario es sometido a procesos de transformación que le confiere capacidad ilimitada de multiplicaciíon, reciben el nombre de Líneas Celulares.

 

CULTIVOS EN MONOCAPA

Las células exhiben una variedad de "comportamientos sociales", lo que hace que su multiplicación sea inhibida cuando establecen contacto entre sí, permitiendo la formación de una monocapa que cubrirá la correspondiente superficie de crecimiento. Las células provenientes de cultivos primarios son las que mejor crecen en ésta condición, dada su estabilidad genética y su naturaleza diploide normal.

Los recipientes para el cultivo de células estacionarias son cajas de Petri, frascos para el cultivo de tejido (T-25, T-75), entre otros, que pueden ser de material de plástico o de vidrio previamente tratado y su desprendimiento para transferirlas a superficies mayores se realizan con agentes proteolíticos como la tripsina.

Cuando se requiere la producción de éste tipo de cultivo en una escala mayor, se debe incrementar el área de la superficie de crecimiento, siendo ideal utilizar botellas en rotación (roller). Mediante éste sistema, las células pueden crecer en toda la parte interna de la pared de la botella, usando un aparato que permite la rotación del roller a una baja velocidad; de esta forma un roller de 1 litro que requiere 100 ml de medio, confiere una superficie de crecimiento de 500 cm2.

Otra forma de aumentar el número de células adherentes por volumen de frasco, es utilizando microperlas (microportadores), que son compuestos en base a dextranos o a vidrio, las que flotan cuando se emplean en cultivos con agitación, lo que le da una mayor disponibilidad de superficie para el crecimiento celular: con 100 ml de medio de cultivo, se logra una superficie de 0.24 m2. La relación superficie-volumen para los rollers es de 0.2-0.7, mientras que para los microportadores es de 122-153.

Existen otras consideraciones que influyen en la utilización de sistemas en monocapa a pesar de las ventajas que tienen los cultivos en suspensión, entre las que están la flexibilidad para desarrollar cultivos primarios o de líneas heteroploídes, la facilidad para la remoción del medio gastado antes de infectar las células y la alta concentración que se obtiene del producto, como en el caso del virus de la Fiebre Aftosa.

 

CULTIVOS EN SUSPENSION

Las Líneas celulares que provienen de cultivos primarios con requerimiento de anclaje a superficies, tienen la propiedad de crecer de manera estacionaria o en suspensión después de un período de adaptación.

Existe evidencia experimental que los sistemas en suspensión también requieren de matrices que son macromoléculas, que sirven de protectores a la superficie celular; éstas macromoléculas se encuentran en el suero, el cual contribuye igualmente con el medio de cultivo, proporcionando un sistema balanceado de nutrientes. Dentro de éstas matrices está el Methocel, esencial para el crecimiento de cultivos en suspensión.

Aunque el cultivo estacionario es ideal cuando se busca la elaboración de productos extracelulares, el cultivo en suspensión es deseable cuando los productos son intracelulares o cuando se presentan problemas con la capacidad de anclaje de un determinado tipo de célula.

El proceso de cultivo continuo ofrece factores económicos decisivos (utilización de mejores equipos, reducida manipulación) cuando se trata de producir cultivos a una mayor escala de operación.

 

CULTIVOS PRIMARIOS

Los cultivos primarios tienen características especiales que los diferencian de las líneas celulares: conservan la morfología de las células del órgano del que fueron aisladas, sus cromosomas tienen un número diploide (2n), su crecimiento in vitro es limitado y hay inhibición por contacto.

El estar más cercanas a las células que las originaron, se ve reflejado en una mejor actividad y funcionalidad similar a su ambiente natural, por lo que en aislamientos primarios de cepas virales éstas tienen mayor sensibilidad que una Línea Celular ya establecida. Igualmente para la producción de vacunas los cultivos primarios son recomendables por tener una baja probabilidad de que se transformen en malignos.

Dentro de las desventajas está la de una mayor probabilidad de presentar virus adventicios o latentes, lo que implica el desarrollo de la adecuada tecnología para el control de calidad.

 

  Apuntes Prof. María Eugenia Muñoz Jara- Sugerencias contenidos Mineduc